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先通過噬菌體介導的同源重組方法構建突變菌株，然后構建同源交換位點（AES），隨后將其整合到結核分枝桿菌噬菌體基因組，獲得噬菌粒（phasmid）；將噬菌粒導入恥垢分枝桿菌，獲得整合有同源交換位點的重組噬菌體，經體外擴增獲得高滴度的重組噬菌體，對結核分枝桿菌進行轉染；將轉染后的結核分枝桿菌涂布到潮霉素抗性的固體培養基，37℃培養4-5 周，挑取單克隆，通過PCR 等方式進行驗證。

目前已成功構建結核分枝桿菌近4000 個基因的重組噬菌體，適用于后期快速獲得結核分枝桿菌基因敲除菌株，同時我們已成功獲得600 多個結核分枝桿菌基因敲除突變菌株。